實時熒光定量PCR儀簡介

一、引言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）是一種在體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。自1983年誕生以來，PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)PCR已逐漸無法滿足對靈敏度、準(zhǔn)確性、定量能力的更高需求。因此，實時熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，簡稱qPCR）應(yīng)運(yùn)而生。

實時熒光定量PCR儀是一種結(jié)合熒光探針或染料信號，實現(xiàn)DNA擴(kuò)增與實時檢測的高通量分子檢測設(shè)備。本文將圍繞其基本原理、儀器結(jié)構(gòu)、工作流程、數(shù)據(jù)分析、技術(shù)優(yōu)勢及應(yīng)用等方面進(jìn)行系統(tǒng)介紹。

二、實時熒光定量PCR的基本原理

1. 核酸擴(kuò)增原理

實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR的基本擴(kuò)增機(jī)制相同，均基于三步循環(huán)：

• 變性（Denaturation）：高溫使雙鏈DNA分離為兩條單鏈；

• 退火（Annealing）：降低溫度，使引物結(jié)合到模板DNA上；

• 延伸（Extension）：DNA聚合酶延伸引物，合成新的DNA鏈。

每個循環(huán)都會使目標(biāo)DNA數(shù)量翻倍，經(jīng)過30~45個循環(huán)后即可獲得大量擴(kuò)增產(chǎn)物。

2. 熒光定量原理

實時PCR通過加入熒光標(biāo)記物，在每一輪擴(kuò)增過程中同步檢測熒光強(qiáng)度的變化，從而反映DNA的累積量。其定量方式主要有兩種：

• 染料法（如SYBR Green）：染料可與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)出熒光，隨DNA濃度增加熒光增強(qiáng)。

• 探針法（如TaqMan探針、MGB、Molecular Beacon）：通過序列特異性探針的熒光信號變化監(jiān)控擴(kuò)增，特異性更高。

熒光信號被檢測器記錄，繪制出擴(kuò)增曲線，從而實現(xiàn)定量分析。

三、儀器結(jié)構(gòu)與功能模塊

實時熒光定量PCR儀主要由以下幾個部分組成：

1. 熱循環(huán)模塊

負(fù)責(zé)提供精確的溫控環(huán)境，確保PCR擴(kuò)增反應(yīng)的溫度條件，包括變性、退火、延伸及熔解過程。該模塊通常采用半導(dǎo)體控溫系統(tǒng)，溫度控制精度在±0.1℃以內(nèi)。

2. 光學(xué)檢測系統(tǒng)

包含激發(fā)光源、濾光片、光路系統(tǒng)和熒光檢測器。激發(fā)光源（如LED或激光器）激發(fā)熒光染料，熒光信號通過濾光片傳輸?shù)紺CD或光電倍增管進(jìn)行記錄。多通道檢測系統(tǒng)可同時監(jiān)控多種熒光信號，用于多重PCR反應(yīng)。

3. 控制與分析軟件

用于實驗設(shè)置、數(shù)據(jù)采集、擴(kuò)增曲線分析、Ct值計算、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、熔解曲線繪制等。軟件界面通常具備參數(shù)可視化、結(jié)果導(dǎo)出、模板管理等功能。

4. 樣本模塊

樣本通常裝載于96孔、384孔或較小通量的反應(yīng)板、管條中，有些儀器還支持快熱系統(tǒng)以縮短反應(yīng)時間。

四、工作流程

1. 樣本準(zhǔn)備

提取目標(biāo)樣本中的DNA或RNA（RNA需逆轉(zhuǎn)錄為cDNA），并準(zhǔn)確定量。引物與探針設(shè)計需依據(jù)目標(biāo)序列，避免二聚體和非特異性結(jié)合。

2. 配制反應(yīng)體系

一般包括以下成分：

• DNA模板

• 上下游引物

• 熒光染料或探針

• PCR緩沖液、Mg2?、dNTPs

• 熱啟動DNA聚合酶

3. 設(shè)置程序參數(shù)

包括初始變性時間、循環(huán)次數(shù)、各階段溫度與時間、熔解曲線分析等。染料和探針類型不同可能需要調(diào)整檢測通道。

4. 實驗運(yùn)行與數(shù)據(jù)采集

儀器自動完成循環(huán)擴(kuò)增和熒光信號采集，實驗結(jié)束后通過軟件分析數(shù)據(jù)，獲取Ct值、Tm值、擴(kuò)增效率等信息。

五、Ct值與定量原理

1. Ct值定義

Ct（Cycle threshold）值是指熒光信號超過背景閾值所對應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。Ct值越小，代表初始模板濃度越高。

2. 相對定量與絕對定量

• 相對定量：使用內(nèi)參基因作為對照，計算目標(biāo)基因的表達(dá)變化，常用2^-ΔΔCt方法。

• 絕對定量：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法，根據(jù)Ct值與模板拷貝數(shù)的對數(shù)關(guān)系，精確測量未知樣本中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。

六、與傳統(tǒng)PCR的比較

七、常見問題與解決策略

1. 非特異性擴(kuò)增

可能由引物設(shè)計不當(dāng)、退火溫度過低或引物濃度過高引起，可通過優(yōu)化退火溫度、重新設(shè)計引物、調(diào)整引物濃度解決。

2. 引物二聚體產(chǎn)生

主要表現(xiàn)為熔解曲線出現(xiàn)低Tm值小峰，通過使用熱啟動酶、優(yōu)化引物設(shè)計或調(diào)整PCR體系濃度可緩解。

3. 熒光信號弱

可能由反應(yīng)體系抑制、模板降解或引物效率低導(dǎo)致，需檢查模板質(zhì)量，優(yōu)化引物或提高反應(yīng)體系兼容性。

4. 多重通道串?dāng)_

應(yīng)校準(zhǔn)濾光片組或檢測通道，確保熒光染料之間不發(fā)生交叉干擾。

八、技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域

1. 基因表達(dá)分析

通過檢測不同處理、組織或時間點中基因的表達(dá)量變化，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號通路研究等。

2. 病原體檢測

利用qPCR高靈敏度，可快速檢測病毒、細(xì)菌、真菌等病原體DNA/RNA，廣泛用于臨床診斷與疫情監(jiān)測。

3. 基因分型與突變分析

通過Tm值變化或探針結(jié)合位點識別不同等位基因，用于SNP檢測、遺傳多態(tài)性研究。

4. 轉(zhuǎn)基因篩查

針對轉(zhuǎn)基因作物中特定外源基因序列進(jìn)行檢測，可實現(xiàn)定量檢測與溯源追蹤。

5. 微量核酸檢測

適用于循環(huán)DNA（cfDNA）、微量殘留病毒等極低拷貝數(shù)樣本的檢測，配合數(shù)字PCR可進(jìn)一步提高分辨率。

九、發(fā)展趨勢與技術(shù)創(chuàng)新

隨著分子診斷、個體化醫(yī)療等領(lǐng)域的發(fā)展，實時熒光定量PCR技術(shù)也不斷演進(jìn)，呈現(xiàn)出以下趨勢：

• 自動化：集成樣本制備、擴(kuò)增和檢測，提高實驗效率。

• 便攜化：發(fā)展移動式實時PCR設(shè)備，適應(yīng)現(xiàn)場檢測需求。

• 高通量：支持384孔板、多通道檢測，提高數(shù)據(jù)產(chǎn)出。

• 精準(zhǔn)分析：與數(shù)字PCR、高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)結(jié)合，拓展應(yīng)用邊界。

十、結(jié)語

實時熒光定量PCR儀通過結(jié)合熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與熒光信號監(jiān)測系統(tǒng)，實現(xiàn)了DNA擴(kuò)增的實時、定量分析，為科研、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、司法等多個領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。其高靈敏度、穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可追溯性，使其成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗中的常用工具。未來，隨著自動化與智能化水平的提升，實時PCR技術(shù)將在更多場景中發(fā)揮作用。